Процедура крионирования проходила в#nbsp;ночное время. В#nbsp;качестве криопротектора был выбран глицерин.
Глицерин может проникать в#nbsp;клетку, если его добавлять при комнатной температуре, или выступать как непроникающее соединение, если его добавлять при температуре О°С. Непроникающие криопротекторы влияют на#nbsp;мембрану клетки, повышая ее#nbsp;проницаемость. Глицерин сейчас широко используется в#nbsp;криобиологии и#nbsp;крионике как криопротектор. С#nbsp;помощью криопротекторов осуществлена длительная обратимая консервация таких биологических объектов, как белые кровяные тельца, сперма, костный мозг, хрящи, почка кролика, часть сердца свиньи.
По#nbsp;субъективным и#nbsp;техническим причинам визуального протоколирования процедуры крионирования с#nbsp;помощью фото- и#nbsp;видеоаппаратуры надлежащим образом произведено не#nbsp;было. Съемка велась посредством использования трех мобильных телефонов, на#nbsp;фотографиях и#nbsp;видео зафиксированы перфузионная установка, оперативный перфузионный сосудистый доступ, процедуры трепанации и#nbsp;обработки цианакрилатом тканей.
При выполнении крионирования не#nbsp;были использованы гистидин и#nbsp;триптофан по#nbsp;причине отсутствия необходимых веществ. Эти вещества используются в#nbsp;составе редуцированной (без маннитола и#nbsp;аллопуринола) модификации кустодиола, который является раствором для кардиоплегии. Ввиду избыточности использования данного раствора в#nbsp;процедуре крионирования, отсутствие данных веществ не#nbsp;должно было оказать существенного влияния на#nbsp;результат.
Кетоглутарат калия использовался для приготовления 6 литров раствора (однако во#nbsp;время процедуры перфузии было использовано 12 литров раствора), ввиду количества данного вещества в#nbsp;наличии. На#nbsp;первичный этап вымывания, в#nbsp;рамках которого происходила элиминация форменных элементов крови из#nbsp;сосудистого русла с#nbsp;помощью изотонического раствора по#nbsp;открытому контуру, потребовалось около 5,5 литров физраствора до#nbsp;получения полностью прозрачного оттока. Таким образом во#nbsp;время процедуры всего использовалось приблизительно 17,5 литров жидкости.
Увеличение количества перфузата произошло ввиду того, что модифицированного раствора кустодиола с#nbsp;10% v/w было недостаточно для проведения полноценного двухчасового этапа перфузии. Вероятно, это связано с#nbsp;несколькими факторами:
1. Избыточное охлаждение тела животного с#nbsp;помощью сухого льда. Микроциркуляторная сеть на#nbsp;периферии могла быть повреждена.
2. У#nbsp;животного был отек легких, ввиду чего существенная часть перфузата перешла в#nbsp;органы грудной клетки.
Потому командой крионистов было решено продолжить процедуру с#nbsp;применением 6 литров раствора Рингера с#nbsp;добавлением 20% v/w глицерина.
Представители команды крионирования высказывают предположение о#nbsp;нерациональности использования триптофана и#nbsp;некоторых других веществ в#nbsp;процедуре и#nbsp;высказывают мысли о#nbsp;том, что простое градиентное замораживание в#nbsp;меньшей степени повреждает ткани.
Проведение сосудистого доступа
Проведено позиционирование животного.
Проведена обработка операционного поля, на#nbsp;передней стороне грудной клетки сбриты волосы.
По#nbsp;срединной линии были выполнены послойные линейные разрезы кожи и#nbsp;подкожно-жировой клетчатки длиною ~10 см.
Отпрепарирована и#nbsp;выделена грудина. При помощи костных кусачек и#nbsp;скальпеля выполнена стернотомия. Легкие отведены в#nbsp;нижние отделы грудной клетки с#nbsp;помощью салфеток.
Концы рассеченных ребер и#nbsp;мягкие ткани вокруг операционного поля были обработаны цианокрилатным клеем.
В#nbsp;ходе перфузии возникли технические сложности: насос выдавал большее давление чем было необходимо, был разрыв перфузионного контура. Для устранения неисправностей была произведена замена головки роликового насоса. На#nbsp;устранение неисправности ушло около 1.5 часа. В#nbsp;это время перфузия продолжалась гравитационным методом#nbsp;— банка с#nbsp;перуфузатом была поднята на#nbsp;высоту 1#nbsp;м над животным. С#nbsp;помощью гравитационной перфузии в#nbsp;сосудистое русло поступило менее 400 мл#nbsp;перфузата.
В#nbsp;левой и#nbsp;правой височных областях были выполнены послойные разрезы кожи, подкожно-жировой клетчатки и#nbsp;сухожильного шлема длиною 1#nbsp;см.#nbsp;Края ран отведены крючками. Распатором отсепарована надкостница. Выполнена трепанация черепа 0.5×0.5 см.#nbsp;Края ран обрабатывались цианакрилатным клеем.
Командой крионирования отмечено, что в#nbsp;первые 2,5−3 часа перфузии было небольшое количество отделяемого, что может свидетельствовать об#nbsp;избыточном охлаждении тканей. Однако последние полчаса-час наблюдался отток в#nbsp;рамках 300−400 мл.
Рефрактометрия для определения содержания глицерина в#nbsp;выделяющейся жидкости не#nbsp;была произведена ввиду ночного времени суток.
Перфузия
Для вымывания использовано ~5 литров холодного физраствора с#nbsp;давлением 100−130 мм. рт. ст. по#nbsp;открытому контуру до#nbsp;получения «прозрачных вод» в#nbsp;оттоке.
Перфузия по#nbsp;закрытому контуру раствором «кустодиола» с#nbsp;добавлением 10% v/w глицерина (температура выставлена -1,5°С). Ежечасно производилась замена циркулирующего перфузата путем перфузии свежим раствором при той#nbsp;же температура и#nbsp;давлении, что и#nbsp;ранее, до#nbsp;получения «чистых промывных вод». Ввиду малого объема циркулирующей крови у#nbsp;крионируемого животного, планировалось использовать 6 литров раствора. Однако ввиду описанных ранее трудностей 6 литров раствора иссякли до#nbsp;окончания перфузии.
Дополнительно приготовлено 6 литров раствора Рингера с#nbsp;добавлением 20% v/w глицерина. Была выставлена температура хладагента в#nbsp;-4,5°С. Продолжена перфузия с#nbsp;давлением 110−140 мм. рт. ст. Аналогично предыдущему пункту происходило добавление свежего раствора в#nbsp;контур, а#nbsp;также ежечасная смена циркулирующего раствора. Спустя 3 часа добавления свежего раствора были прекращены. Перфузия продолжалась до#nbsp;окончания циркулирующей жидкости.
Завершающий этап
Выполнен забор образцов ДНК в#nbsp;12 криопробирок.
После окончания перфузии сердечно-сосудистого русла из#nbsp;грудной полости были удалены салфетки, отсоединены от#nbsp;перфузионного контура сосудистые катетеры.
Верхние и#nbsp;нижние конечности фиксированы друг к#nbsp;другу при помощи марли в#nbsp;«компактом положении» для уменьшения линейных размеров.
Тело крионируемого животного помещено в#nbsp;термопакет, обложено снаружи пластиковыми бутылями с#nbsp;жидкой водой, засыпано со#nbsp;всех сторон сухим льдом в#nbsp;пенопластовом термоящике.
Выполнена доставка термоящика и 12 криопробирок с образцами в хранилище в Подмосковье, там животное и образцы были помещены на захолаживание и в дальнейшем на долгосрочное хранение в специальных металлических контейнерах в дьюар с жидким азотом.