ООО «Открытая крионика»
ООО «Институт биологии старения»
Введение
Процедура крионирования проходила в ночное время. В качестве криопротектора был выбран глицерин.
Глицерин может проникать в клетку, если его добавлять при комнатной температуре, или выступать как непроникающее соединение, если его добавлять при температуре О°С. Непроникающие криопротекторы влияют на мембрану клетки, повышая ее проницаемость. Глицерин сейчас широко используется в криобиологии и крионике как криопротектор. С помощью криопротекторов осуществлена длительная обратимая консервация таких биологических объектов, как белые кровяные тельца, сперма, костный мозг, хрящи, почка кролика, часть сердца свиньи.
По субъективным и техническим причинам визуального протоколирования процедуры крионирования с помощью фото- и видеоаппаратуры надлежащим образом произведено не было. Съемка велась посредством использования трех мобильных телефонов, на фотографиях и видео зафиксированы перфузионная установка, оперативный перфузионный сосудистый доступ, процедуры трепанации и обработки цианакрилатом тканей.
При выполнении крионирования не были использованы гистидин и триптофан по причине отсутствия необходимых веществ. Эти вещества используются в составе редуцированной (без маннитола и аллопуринола) модификации кустодиола, который является раствором для кардиоплегии. Ввиду избыточности использования данного раствора в процедуре крионирования, отсутствие данных веществ не должно было оказать существенного влияния на результат.
Кетоглутарат калия использовался для приготовления 6 литров раствора (однако во время процедуры перфузии было использовано 12 литров раствора), ввиду количества данного вещества в наличии. На первичный этап вымывания, в рамках которого происходила элиминация форменных элементов крови из сосудистого русла с помощью изотонического раствора по открытому контуру, потребовалось около 5,5 литров физраствора до получения полностью прозрачного оттока. Таким образом во время процедуры всего использовалось приблизительно 17,5 литров жидкости.
Увеличение количества перфузата произошло ввиду того, что модифицированного раствора кустодиола с 10% v/w было недостаточно для проведения полноценного двухчасового этапа перфузии. Вероятно, это связано с несколькими факторами:
1. Избыточное охлаждение тела животного с помощью сухого льда. Микроциркуляторная сеть на периферии могла быть повреждена.
2. У животного был отек легких, ввиду чего существенная часть перфузата перешла в органы грудной клетки.
Потому командой крионистов было решено продолжить процедуру с применением 6 литров раствора Рингера с добавлением 20% v/w глицерина.
Представители команды крионирования высказывают предположение о нерациональности использования триптофана и некоторых других веществ в процедуре и высказывают мысли о том, что простое градиентное замораживание в меньшей степени повреждает ткани.
Проведение сосудистого доступа
Проведено позиционирование животного.
Проведена обработка операционного поля, на передней стороне грудной клетки сбриты волосы.
По срединной линии были выполнены послойные линейные разрезы кожи и подкожно-жировой клетчатки длиною ~10 см.
Отпрепарирована и выделена грудина. При помощи костных кусачек и скальпеля выполнена стернотомия. Легкие отведены в нижние отделы грудной клетки с помощью салфеток.
Концы рассеченных ребер и мягкие ткани вокруг операционного поля были обработаны цианокрилатным клеем.
Полостными и сосудистыми ножницами произведено выделение верхней полой вены, плечеголовного ствола и дуги аорты. Периферическими катетерами 12 Gпропунктированы сосуды: верхняя полая вена — отводящий конец, и плечеголовной ствол — приводящий конец. Успешность постановки катетера оценивалась также и по появлению в них крови. Для герметизации периферические концы катетеров фиксированы к стенкам сосуда цианокрилатным клеем. Дистальные концы катетеров подключены к перфузионному насосу.
Началась перфузия.
В ходе перфузии возникли технические сложности: насос выдавал большее давление чем было необходимо, был разрыв перфузионного контура. Для устранения неисправностей была произведена замена головки роликового насоса. На устранение неисправности ушло около 1.5 часа. В это время перфузия продолжалась гравитационным методом — банка с перуфузатом была поднята на высоту 1 м над животным. С помощью гравитационной перфузии в сосудистое русло поступило менее 400 мл перфузата.
Во время перфузии по возможности применялся цианакрилат в местах появлявшихся «протёков».
Трепанация черепа
В левой и правой височных областях были выполнены послойные разрезы кожи, подкожно-жировой клетчатки и сухожильного шлема длиною 1 см. Края ран отведены крючками. Распатором отсепарована надкостница. Выполнена трепанация черепа 0.5×0.5 см. Края ран обрабатывались цианакрилатным клеем.
Командой крионирования отмечено, что в первые 2,5−3 часа перфузии было небольшое количество отделяемого, что может свидетельствовать об избыточном охлаждении тканей. Однако последние полчаса-час наблюдался отток в рамках 300−400 мл.
Рефрактометрия для определения содержания глицерина в выделяющейся жидкости не была произведена ввиду ночного времени суток.
Перфузия
- Для вымывания использовано ~5 литров холодного физраствора с давлением 100−130 мм. рт. ст. по открытому контуру до получения «прозрачных вод» в оттоке.
- Перфузия по закрытому контуру раствором «кустодиола» с добавлением 10% v/w глицерина (температура выставлена -1,5°С). Ежечасно производилась замена циркулирующего перфузата путем перфузии свежим раствором при той же температура и давлении, что и ранее, до получения «чистых промывных вод». Ввиду малого объема циркулирующей крови у крионируемого животного, планировалось использовать 6 литров раствора. Однако ввиду описанных ранее трудностей 6 литров раствора иссякли до окончания перфузии.
- Дополнительно приготовлено 6 литров раствора Рингера с добавлением 20% v/w глицерина. Была выставлена температура хладагента в -4,5°С. Продолжена перфузия с давлением 110−140 мм. рт. ст. Аналогично предыдущему пункту происходило добавление свежего раствора в контур, а также ежечасная смена циркулирующего раствора. Спустя 3 часа добавления свежего раствора были прекращены. Перфузия продолжалась до окончания циркулирующей жидкости.
Завершающий этап
Выполнен забор образцов ДНК в 12 криопробирок.
После окончания перфузии сердечно-сосудистого русла из грудной полости были удалены салфетки, отсоединены от перфузионного контура сосудистые катетеры.
Произведено послойное ушивание раны обвивным швом.
Верхние и нижние конечности фиксированы друг к другу при помощи марли в «компактом положении» для уменьшения линейных размеров.
Тело крионируемого животного помещено в термопакет, обложено снаружи пластиковыми бутылями с жидкой водой, засыпано со всех сторон сухим льдом в пенопластовом термоящике.
Выполнена доставка термоящика и 12 криопробирок с образцами в хранилище в Подмосковье, там животное и образцы были помещены на захолаживание и в дальнейшем на долгосрочное хранение в специальных металлических контейнерах в дьюар с жидким азотом.