Вы здесь

Крионика - "холодная" наука.

Содержание.

Введение.

1. Предпосылки возникновения крионики.

2. Анабиоз - основа крионики.

3. Проблемы криобиологии.

4. Криопротекторы.

5. Вас оживит молекулярный робот.

6. Скорость холода.

7. Хекстент - спасительная кровь.

8. Человек из холодильника.

9. Свежемороженые органы.

10. На что еще способен холод?

Заключение.

Список использованных источников.

#Введение.

Фантастические представления о волшебном сне, который длится много лет и после которого человек возвращается к жизни, не постарев, нашли отражение в трудах философов, писателей и ученых, в сказках и легендах. Эндимион, возлюбленный Селены-Луны, король Артур, Спящая Красавица — все они спали долгие века, оставаясь бессмертными и прекрасными. (Кстати, в европейской традиции рыцарь или принцесса зачастую покоятся в ледяном или хрустальном гробу.)

Со временем литературные версии вечного сна становились менее сказочными и более «научными». В наши дни все дальше и дальше ученые при помощи биологии, химии и медицины продвигаются вперед к вечной жизни. Многие ищут ее в стволовых клетках, клонирование, в гене бессмертия т.д. В данной работе будут рассмотрены реалии и перспективы “холодной” науки - крионики. На что мы можем рассчитывать уже сегодня? Чего ждать завтра? Чему не быть никогда?

#1. Предпосылки возникновения крионики.

 Термин "анабиоз" был предложен в 1873 году немецким ученым Вильгельмом Прейером в его сводке по исследованию феномена временного прекращения жизнедеятельности. Это название происходит от греческих слов "ана" - вверх и "биос" - жизнь и переводится как возврат к жизни. Считается, что анабиоз был открыт в начале 18 века голландским ученым Антони Ван Левенгуком. При микроскопическом исследовании проб песка, взятого из водосточного желоба, он обнаружил, что мельчайшие животные (из класса коловратки, тип круглые черви) будучи полностью высушенными и не подававшие никаких признаков жизни, при добавлении воды оживали. Хотя сам Левенгук считал, что полного высушивания и остановки жизни не происходит, уже в середине 18 века на основе экспериментов по высушиванию, проведенных другими учеными, сложилось мнение, что приостановка жизни все-таки возможна. В последующее время были проведены многочисленные опыты по обратимому высушиванию и замораживанию (в том числе почти до абсолютного нуля и в вакууме) разных микроскопических (длиной не больше нескольких миллиметров) биологических объектов приспособленных к перенесению анабиоза в естественных условиях (круглые черви - коловратки и нематоды, тихоходки, сине-зеленые водоросли, семена). Но несмотря на то, что эти опыты убедительно доказывали реальность существования анабиоза, фактически дискуссия о возможности обратимого прекращения жизнедеятельности не прекращалась до 50-х годов нашего века, когда накопленные экспериментальные данные и сложившееся к этому времени понимание физико-химических основ жизни (в том числе того факта, что структура живой материи полностью определяет ее функцию) развеяли последние сомнения в возможности анабиоза.

Открытие анабиоза обозначило тот факт, что жизнь может быть в принципе обратимо приостановлена при помощи замораживания. Еще в древности (первые упоминания относятся к началу нашей эры) было известно, что некоторые замороженные рыбы могут оживать после оттаивания. С середины 17 века эти наблюдения стали дополняться успешными научными экспериментами по замораживанию до температур несколько ниже 0 градусов и последующему оживлению животных, приспособленных для перенесения сильного охлаждение в естественных условиях: рыб, земноводных, круглых червей, куколок бабочек. Состояние, в котором находились животные в этих экспериментах, нельзя назвать анабиозом, т.к. в действительности это было не полное замораживание, а сочетание частичного замораживания с переохлаждением, т.е. вода в организме замораживалась не полностью и, соответственно, жизнедеятельность прекращалась не полностью, а только значительно замедлялась.

До сих пор не изобретены методы, позволяющие произвести обратимое полное замораживание животных больших размеров. Однако, идея, что такие методы могут быть созданы, высказывалась многократно. Так еще во второй половине 17 века на основании наблюдений и экспериментов по замораживанию - переохлаждению английским физиком Робертом Бойлем было высказано предположение о возможности успешного замораживания - размораживания млекопитающих. Затем, после открытия анабиоза, английским хирургом и анатомом Джоном Хантером во второй половине 18 века было высказано более радикальное предположение, что можно продлить жизнь человека на любой срок, путем его циклического замораживания и оттаивания. Чтобы проверить свою гипотезу Хантер провел эксперимент по замораживанию рыб, но, так как он окончился неудачно (по всей вероятности это было полное замораживание), Хантер оставил эту идею.

Другие эксперименты по замораживанию больших животных, предпринимавшиеся в течение 19 века, также были неудачными. Однако, в начале 20 века русский физик Порфирий Бахметьев, основываясь на своих успешных опытах с куколками бабочек (где опять-таки было переохлаждение, а не анабиоз), снова высказал предположение, что все-таки можно найти такие условия, при которых окажется возможным осуществить замораживание и оттаивание человека и использовать эту практику для продления жизни Предпосылки к практической реализации идеи применения анабиоза для продления жизни окончательно сложились в 50-х годах. Безусловно, основной предпосылкой явился значительный прогресс в области криобиологии, обозначивший теоретическую достижимость замораживания человека и давший направление для поисков наиболее безопасного метода для этой цели. Но выдающиеся достижения того времени в других областях науки также имели большое значение.

Открытия 50-х годов в области молекулярной биологии в основном прояснили картину клеточной и молекулярной природы жизни. Это позволило высказать ключевое предположение о том, что повреждения клеток, происходящие в начальные стадии смерти и от замораживания, теоретически не могут быть настолько велики, чтобы наука будущего не могла их репарировать (восстановить).

И, наконец, криогенные технологии охлаждения газов до сверхнизких температур (до жидкого состояния) обрели промышленный масштаб, что явилось необходимой технико-экономической предпосылкой реализации идеи. Все это сложенное вместе и дало толчок созданию метода замораживания человека для переноса его в будущее, где его можно будет разморозить и оживить с помощью передовых медицинских технологий. Впоследствии этот метод получил название крионика (от греческого слова "криос" - холод).

#2. Анабиоз-основа крионики.

Крионика, включает в себя криобиологию, криогенную инженерную практику и практику клинической медицины. Она используется для консервации людей, умерших по какой-либо причине, путем их замораживания до сверхнизких температур, с целью переноса их в тот момент в будущем, когда будет доступна технология восстановления всех функций организма. В основе крионики лежит анабиоз.

В природе есть множество живых существ, способных обратимо замедлять жизненно важные процессы на длительный срок, иногда на несколько лет. Как бы ни называли ученые этот феномен (состояние покоя, оцепенение, зимняя спячка и др.), все это разные степени анабиоза, при котором происходит существенное торможение как выработки энергии, так и ее потребления. Более того, организмы пребывающие в подобном состоянии, обладают исключительной устойчивостью к внешним воздействиям: колебаниям температуры, дефициту кислорода и даже физическим повреждениям.

В США с недавних пор стали продаваться весьма своеобразные игрушки для детей — коробочки с маленькими сушеными червячками и незатейливой инструкцией: “Высыпать в воду и ждать”. Через некоторое время эти микроскопические существа — с виду абсолютно мертвые — оживали и начинали деловито плавать из стороны в сторону, разыскивая еду. Классический и наиболее удивительный пример анабиоза — обычные червячки коловратки, которые чаще всего используются в качестве корма для аквариумных рыб (фактически, американским детям продают сухой корм по завышенной цене).

Чудесное оживление коловраток, изученных Антони Левенгуком, два века будоражило умы ученых. Коловратки являются, пожалуй, самыми живучими существами на нашей планете. Их можно помещать в вакуум, кипятить, сушить, замораживать до абсолютного нуля (-273 градуса по Цельсию) — они впадут в безжизненное состояние, но при погружении в воду воскреснут. Причем время, в течение которого они могут пребывать в анабиозе, по всей видимости, ничем не ограничено. Известен случай, когда на сухой мох, пролежавший в музее около 150 лет, капнули водой — и в нем появились живые коловратки.

В анабиозе все процессы предельно замедляются, и видимых проявлений жизни нет. Такое состояние у некоторых организмов может продолжаться неограниченно долго. Механизм, выработанный для противодействия неблагоприятным природным условиям, существует у некоторых земноводных и пресмыкающихся, но считался невозможным для млекопитающих: зимняя спячка, в которую впадают некоторые из них, только отдаленно напоминает анабиоз. Однако опыты современных криобиологов говорят об обратном.

Так же оттаивают и продолжают жить после размораживания не только тритоны и лягушки, замороженные рыбы. Экспериментально установлено, что мелкие грызуны (крысы, мыши, хомяки) после временного охлаждения до температуры -9 градусов сохраняли все свои жизненные функции. Клетки их мозга выдерживали кислородное голодание и не погибали.

Выяснилось, что в состоянии гипотермии организм повышает сопротивляемость ко многим вредным внешним воздействиям. А клетки коры головного мозга в таких условиях выдерживают длительное отсутствие кровообращения и не погибают. Оживляли даже переохлажденных обезьян, когда они уже не дышали, и сердце их не билось. Зафиксировано немало случаев, когда люди возвращались из состояния, близкого к анабиозу, без особых физических или неврологических последствий.Так, в мае 1999 года норвежская лыжница пробыла в ледяной воде больше часа. Когда ее спасли, она была в состоянии клинической смерти, сердцебиение и дыхание отсутствовали. Температура ее тела упала до 14 градусов Цельсия. Ее реанимировали, и с тех пор она находится в нормальной физической и психической форме.

Еще один нашумевший случай произошел в феврале 2001 года, когда 14-месячная канадская девочка Эрика Нордби (Erika Nordby) пробыла ночью на 24-градусном морозе в одних памперсах почти два часа. Когда девочку нашли, температура ее тела была 16 градусов Цельсия, а сердце не билось. Девочка была успешно реанимирована.

По мнению господина Рота, в будущем могут быть разработаны специальные смеси, с помощью которых ввод человека в состояние анабиоза будет почти таким же простым делом, что и погружение его в наркотический сон с помощью анестетиков. Эта технология пригодится не только космонавтам, летящим к какому-нибудь Марсу или Юпитеру, но и жертвам инфарктов или инсультов, зачастую умирающим из-за несвоевременной врачебной помощи.

Глубокий холодовой анабиоз — это состояние биологических объектов, при котором уровень метаболизма приближается к нулю, не прерываются только атомарные и молекулярные процессы; такое состояние может длиться неограниченное время, а после отогрева восстанавливаются все физиологические свойства объектов. Часто представление об анабиозе как о «временной смерти» неверно, поскольку смерть в научном понимании — необратимое разрушение живой системы. При истинном анабиозе микроструктура объектов не повреждена или повреждения носят обратимый характер.

Вообще говоря, наукой установлен принцип понижения устойчивости к сверхнизким температурам с повышением уровня организации живых систем. Вопрос лишь в том, где пролегает граница: при каких условиях холодовой анабиоз возможен, а при каких — нет.

У разных живых существ криоустойчивость различна. Долгое время считалось, что все микроорганизмы одинаково хорошо переносят замораживание. Сегодня мы знаем, что разные классы и штаммы микроорганизмов обладают неодинаковой криоустойчивостью: у них по-разному кристаллизуется внутриклеточная вода, изменяются свойства мембранных компонентов и активность метаболизма. (Кстати, криоустойчивость неодинакова не только у бактерий, но даже у таких примитивно организованных объектов, как вирусы.)

Устойчивость микроорганизмов к замораживанию можно повысить, культивируя их в специально подобранных средах, а также выбирая для криоконсервирования определенную стадию жизненного цикла. Кроме того, многое зависит и от условий, в которых протекает охлаждение. Наиболее криоустойчивыми оказались кокковые формы микроорганизмов и споры: при быстром охлаждении жизнеспособными остается до 100% клеток!

При переходе от бактериальных клеток к простейшим организмам, имеющим ядро, устойчивость сразу падает. Дрожжи переносят замораживание гораздо хуже бактерий, но и к ним ученые нашли подход. Для них оптимальными оказались либо низкие скорости охлаждения (0,4*С/мин), либо двухэтапное замораживание (сперва медленное охлаждение, потом быстрое погружение в жидкий азот) в средах, содержащих слабые криозащитные вещества типа пептона, глюкозы, дрожжевого экстракта. Сейчас уже возможно перевести в состояние глубокого холодового анабиоза практически все одноклеточные объекты и суспензии клеток. Исключение составляют пресноводные простейшие: даже незначительные повышения концентрации солей на этапах кристаллизации для них смертельны.

Важно также и то, что процессы метаболизма не прекращаются даже при -100 градусах. Считается, что гарантированное блокирование жизни происходит при -196. Однако при очень долгом (сотни лет) хранении тела теоретически возможно его медленное старение на молекулярном уровне.

Но и в тех клетках, которые после выхода из анабиоза остались живы, могут быть повреждения. Внешне это проявляется в замедленном делении. В размороженных клетках подавлен синтез основных белков, изменяется нуклеиновый обмен, дыхательная активность. Зато сразу после криоконсервирования и спустя 30 минут от начала культивирования в клетках кишечной палочки начинают синтезироваться криостресс-протеины: особые белки, задача которых — противостоять опасному охлаждению. Семейство этих белков по молекулярной массе отличается от семейства белков теплового шока. Белки теплового шока - защищают клетку не только от перегрева, но и от множества других опасностей. Однако против замерзания сражаются другие белки. Кстати, если синтез белков теплового шока индуцируется при повышении температуры тела всего на 1-3'С выше физиологических значений, то синтез криостресс-протеинов не начинается даже при снижении температуры до ОоС.

Криостаз включает в себя процесс охлаждения организма до температуры жидкого азота (77 К) и хранение его при этой температуре. После получения официального свидетельства о смерти пациента специальная бригада начинает подготовку тела к охлаждению. Подключает его к аппарату искусственного дыхания и кровообращения. Затем кровь в организме заменяют на криопротектор, ткани организма тоже насыщаются криопротектором и начинается медленное охлаждение. После того как температура тела достигает 77 К его помещают в криостат с жидким азотом, где оно хранится длительное время. Для того, чтобы поддерживать необходимую для хранения температуру, требуется добавлять периодически в криостат жидкий азот. Предполагается, что в таком состоянии тело хранится до тех пор, пока не наступит время, когда появятся медицинские технологии, способные исправить все повреждения в организме и оживить его. По отдельным прогнозам это время может составить от 50 до 100 лет.

#3. Проблемы криобиологии.

Как писал еще Де Бройль: "Каждый успех наших знаний ставит больше проблем, чем решает”. В наши дни пока не существует методов, которые позволили бы заморозить и разморозить без повреждений целый орган, не говоря об организме. В подобных опытах мы всегда наблюдаем отек, гипоксию, разрушение клеток. Причины понятны. Орган — многоклеточная, гетерогенная система, имеющая форму, массу и объем. Следовательно, при замораживании в нем возникают температурные градиенты, холод не распространяется в тканях мгновенно. Клетки, из которых состоит орган, попадают в неодинаковые условия. В то время как клетки поверхностных слоев оказываются уже закристаллизованными, более глубокие слои находятся лишь в состоянии переохлаждения. Кроме того, орган по своему морфологическому строению не бывает однородным, поэтому при замораживании возникают проблемы с сосудами и нервными волокнами: ведь каждой ткани, каждому типу клеток нужен свой режим замораживания.

Еще одна проблема – это действие низких температур на мозг. Эксперименты показали, что ткани и клетки мозга более устойчивы к действию холода, чем другие. Порой приходится слышать и даже читать такие рассуждения: если мы научимся замораживать мозг, то зачем замораживать тело? Достаточно сохранить мозг и несколько клеток, из которых методом клонирования можно создать тело для новой жизни воскрешенного пациента... При этом обычно упускают из виду, что клонированное тело должно быть лишено собственного мозга (иначе вся операция мало чем отличается от убийства); вырастить же взрослое здоровое млекопитающее без головного мозга — задача абсолютно фантастическая. Но главное не в том. Уже при температуре тела +18С практически не удается записать энцефалограмму мозга, а при +4С исчезает его электрическая активность, утрачиваются связи и взаимодействия между структурами мозга, его регуляторная функция. При дальнейшем понижении температуры нарушения принимают необратимый характер. Мы не рассчитываем в ближайшие 5-10 лет заморозить мозг таким образом, чтобы после его отогрева сохранились причинно-следственные ассоциации, которые составляют структуру памяти человека, то есть, по сути, лежат в основе личности. Если верно, что вместилище индивидуальности — мозг, то замораживание эту индивидуальность неминуемо сотрет. Именно это больше всего смущает и директора Института мозга человека Российской академии наук, члена-корреспондента РАН Святослава Медведева: “Главный... вопрос в том, можно ли “безнаказанно” прервать функционирование мозга. Жизнь, скорее всего, непрерывна. Если вы допустите остановку мозга хотя бы на несколько минут, то хранящаяся в нем информация о личности будет утрачена, возможно, насовсем. И последующее пробуждение может дать нам “чистую доску” — человека, забывшего все, кроме первичных рефлексов. А человек — это память. Речь идет, прежде всего, о коре головного мозга, где “записаны” главные сведения о личности, ее истории, привычках. Поэтому с научной точки зрения метод нереален, если исчезает память. В принципе, это поддается проверке, если подвергнуть крионической процедуре животное, имеющее условные рефлексы, — сохранятся ли они после размораживания? Я считаю, что нет, но вдруг...”.

Человек умирает не мгновенно. После остановки сердца и прекращения дыхания (клиническая смерть) еще примерно в течение часа возможно вернуть его к нормальной жизнедеятельности (реанимировать). Даже после прекращения биоэлектрической активности мозга и при отсутствии рефлексов (что означает смерть мозга или биологическую смерть - после нее врач или другое ответственное лицо вправе выдавать свидетельство о смерти) большая часть клеток в органах человека еще жива, а умершие клетки еще не разрушены полностью - многие клеточные структуры еще функционируют. Еще сохраняется структура связей между нервными клетками головного мозга, которая является основой долговременной памяти и основным субстратом существования человека как личности, а значит имеется принципиальная возможность (при проведении репарации на клеточном и молекулярном уровнях - что вполне может быть доступно медицине будущего) реанимировать человека и после биологической смерти.

Интересную историю рассказывают в стенах Французской Академии Наук. Антуан Лавуазье был гильотинирован как "генеральный фермер" - член Королевского колхоза, собиравшего налоги с привозивших в Париж кур крестьян. Перед казнью Лавуазье просил палача, показывая народу отрубленную голову, заглянуть ему в глаза: если Лавуазье подморгнет правым (но не левым глазом), то будет сделано научное открытие, которое следует сообщить академии: голова мыслит хоть еще несколько секунд. Но палач ответил: научное открытие этого эксперимента будет нулевое - если бы они ничего не чувствовали, то мне не приходилось бы каждую неделю менять корзины с обкусанными краями, куда эти головы падают. В связи с этим, в крионике вводится понятие информационной (полной, окончательной) смерти. Когда необратимо потеряна информация, необходимая для реанимации человека как полноценной личности с сохранением им памяти о своем прошлом и своего я. Сложность в то, что точный момент смерти определить современная наука не в состоянии. Ведь все зависит не только от сегодняшних знаний о механизмах мозга человека и о молекулярных и клеточных основах жизни (которые далеко не полны), но и от возможностей будущих медицинских технологий использовать информацию, сохранившуюся в мозге, для оживления человека. Однако, учитывая вышеизложенное, а также тот факт, что при остановке кровообращения и охлаждения тела до 20-25 град. человек может жить несколько часов (а после клинической смерти человек охлаждается естественным образом), можно предположить, что информационная смерть может отставать от биологической по крайней мере на несколько часов (а, быть может, и на несколько десятков часов).

Наконец, можно сколько угодно спорить о том, что будет через сто или двести лет. Но очевидно, что в организме человека, замороженного по современным технологиям до азотных температур, возникают повреждения, несовместимые с жизнью, и наивно предполагать, что когда-то в будущем станет возможна молекулярная починка таких повреждений.

Теоретические и экспериментальные исследования 20-х - 40-х годов убедительно показали, что обратимо полностью заморозить большие организмы нельзя. Еще в 1940-1960 годы американский криобиолог Б.Дж. Люйе изучил процессы кристаллизации в биообъектах при глубоком охлаждении. Он высказал мнение, что расширение, создающееся при кристаллизации льда, разрушает структуры цитоплазмы клеток, повреждают мембраны и органеллы клетки. Лишь хомяки переносят частичную кристаллизацию тканей. Позже американский криобиолог П. Мейзур экспериментально обосновал двухфакторную гипотезу криоповреждения. Согласно этой теории, клетку убивают не только кристаллы льда, но и обезвоживание, при котором в клетке повышается концентрация солей — а это, в свою очередь, приводит к денатурации белков и разрушению структур цитоплазматической мембраны.

Известно, что в США, где существует уже целая индустрия крионики, фирмы заново замораживают своих клиентов один раз в 8 лет. Это делается для того, чтобы не дать ни единого шанса никаким случайностям. Исследователи считают, что даже при сверхнизких температурах возможен тоннельный эффект: проскакивание отдельных атомов внутри тканей. То есть происходит микроскопический обмен веществ. Теоретически за десятки или сотни лет хранения замороженное тело может стареть. Ведь неизвестно, когда будет возможно полноценное размораживание. Таким образом, попытки экстраполировать принципы замораживания простейших и клеток на органы и особенно на организм теплокровных всегда неадекватны и в лучшем случае имеют лишь теоретическое значение.

Существует множество нерешенных проблем на этом пути и главная - умение вернуть к жизни организм, который был заморожен. Как бы то ни было поставлена заманчивая проблема, - умирая, заснуть, пробудиться через десятилетия и оказаться в новом мире.

#4. Криопротекторы.

Одной из проблем при криозамораживании, как уже говорилось, является повреждение клетки кристаллами льда. Однако уже сейчас у ученых есть методы как этого избежать. Одним из путей решения этой проблемы является использование криопротекторов.

Морозоустойчивые виды растений и животных содержат вещества, которые защищают их от вредного действия холода. Это могут быть глицерин, углеводы: сахароза, глюкоза и другие. (Например, ткани личинок арктических насекомых, обитающих на островах северного побережья Канады, зимой накапливают глицерин). Американские ученые показали, что в лапках лягушек, способных переносить температуры от -3 до 8С, интенсивно образуется глицерин либо глюкоза в момент появления первых кристалликов льда. Природные химические соединения, защищающие растения и животных от переохлаждения, называются биологическими антифризами. Как правило, это биополимеры, имеющие в молекуле полярный кислород, который способен взаимодействовать с водородными связями. Благодаря им влага в тканях не замерзает и кристаллы не разрушают ткани. Используя эти наблюдения, ученые разработали технологии криоконсервирования биологических объектов с применением криопротекторов. Они связывают воду в организме и не дают ей расширяться при замерзании. Процесс замораживания тел с применением криопротекторов называется - ветрификация. Эти технологии позволяют хранить при низких температурах клеточные суспензии: клетки крови, костного мозга, репродуктивные клетки, гепатоциты, а также эмбрионы человека и животных. Среди химических соединений с криозащитными свойствами (их известно около ста) активными криопротекторами оказались единичные представители разных классов веществ: многоатомные спирты, оксиды, амиды и другие.

В 40-х годах 20 века, в качестве криопротектора был использован глицерин. Защитные свойства его при замораживании растительных тканей были открыты еще в начале 20 века шведским ботаником Лидфорссом и русским ботаником Н.А. Максимовым. Появились новые опыты по успешному замораживанию отдельных фрагментов тканей млекопитающих и человека с использованием глицерина. Дальнейшие исследования позволили создать вещества - витрификаторы, под действием которых вода переходит в аморфное состояние и становится безопасной для организма при замораживании. В 1956 году французский ученый Луи Рэ заставил биться сердце куриного эмбриона, пропитанное таким протектором (глицерином), через несколько месяцев пребывания в жидком азоте.

Опыты по замораживанию золотистого хомячка показали, что если в тканях головного мозга в лед превращается не более 60% воды, то при оттаивании хомячки выживают без сколько-нибудь заметных отклонений в поведении. Если же льда образуется больше, оттаявшие хомячки утрачивают память и координацию движений. В качестве криопротектора использовался глицерин, который обеспечивал именно такой процент образования льда, однако оказывал побочное токсическое действие на мозг хомячка.

Как и глицерин многие криопротекторы токсичны и если, не удалить их до окончания анабиоза, они могут убить объект.

Однако уже сейчас разработаны способы криоконсервации клеток, не требующие последующего удаления токсичных криопротекторов. В опытах с эритроцитами человека использовали внеклеточный криопротектор, полиэти-леноксид с молекулярной массой 1500. Удалять после размораживания его не нужно: в количествах, необходимых для защиты от кристаллизации, он практически безвреден. Эта особенность метода очень важна для медицинской практики, поскольку сокращает время от разморозки биоматериала до операционного стола. Кроме того, найден режим охлаждения, при котором после размораживания выживают до 96-98% клеток. Эта технология сейчас проходит клинические испытания в Японии у профессора С. Сумиды. Интересно отметить, что Сумида разморозил эритроциты после тридцати лет хранения в жидком азоте, и оказалось, что жизнеспособность и функциональные свойства клеток не утеряны. Правда, эритроциты — специализированные клетки, приспособленные исключительно для переноса кислорода и углекислого газа и лишенные даже ядра. Тем He менее это значит, что живые системы могут быть весьма устойчивыми к сверхнизким температурам.

Для предотвращения повреждения мышцы сердца крысы ученые добавили в консервирующий раствор белки, обнаруженные в организме арктических рыб. Благодаря им на протяжении 24 часов сердце оставалось жизнеспособным при минусовой температуре.

Это исследование на сердцах лабораторных крыс было проведено в Исследовательском институте кардиологии Неуфелда в городе Рамат-Хашарон, Израиль, под руководством доктора Габриеля Амира (Gabriel Amir). По его словам, возможность использования белков, обеспечивающих сохранение сердца при низких температурах, открывает новые захватывающие перспективы в трансплантологии. В ходе эксперимента сердца лабораторных крыс заполнялись специальным консервирующим раствором, разработанным в Университете Висконсина при температуре 4С. Органы хранились при двух температурах: 4С и -1,3С в течение 12, 18 и 24 часов. При минусовой температуре в раствор добавляли "морозоустойчивые" белки из расчета 15 миллиграмм на миллилитр. На следующей стадии эксперимента сердца пересаживались крысам, причем ученые оценивали их сократительную функцию по шестибальной шкале. После этого под электронным микроскопом изучалась сохранность структур сердечной мышцы. Как и ожидалось, при использовании белков, структура и функция мышц сохранялась лучше, например, спустя 24 часа в среднем на пять баллов против двух.

Доклад о результатах исследования был сделан на 39-ой ежегодной конференции Общества торакальных хирургов в Сан-Диего, Калифорния.

 #5. Вас оживит молекулярный робот.

 Новый всплеск интереса к крионике наблюдается в последние 10-15 лет, после того, как был создан туннельный микроскоп, и стали проводиться более интенсивные исследования в области нанотехнологий. Одно из наиболее интересных направлений - это создание молекулярных роботов, т. е. роботов, размером с молекулу.

Эти крошки будут содержать вычислительные устройства и манипуляторы, позволяющими работать с молекулами - перемещать их и изменять их структуру, т.е. заниматься молекулярной хирургией. Например, по принципу молекулы РНК, которая строит из аминокислот молекулу белка. Предполагается такой алгоритм деятельности молекулярных роботов. Таким образом, появилась идея использования молекулярных роботов для успешного возвращения к жизни организмов, подвергшихся криостазу. Задача молекулярных роботов будет заключаться в ликвидации повреждений тканей организма и клеток внутри них, возникающих при замораживании, а также разрушений клеток вследствие кислородного голодания. Сценарий оживления можно представить следующим образом. В тело внедряются молекулярные роботы. Их общее количество может составлять миллионы миллиардов. Они исследуют повреждения клеток, их которых состоят ткани организма, устраняют их. При этом они устраняют не только те повреждения, которые появились в результате замораживания, но и те, которые явились причиной смерти пациента. В процессе работы молекулярные роботы обмениваются информацией между собой, а также с внешним суперкомпьютером. По окончании работы молекулярные роботы покидают организм естественным путем (например, через дыхательные пути).

Ученые считают, что подобные роботы будут созданы лет через 50 - 100.

#6. Скорость холода.

 Избежать летальных повреждений можно путем сверхбыстрого замораживания и сверхбыстрого отогрева клеток, при котором вместо кристаллизации происходило бы стеклование внутриклеточной воды. Однако еще П. Мейзур пришел к убеждению, что для каждого вида клеток нужна своя оптимальная программа скорости охлаждения, способная обеспечить максимальную сохранность. При скорости охлаждения 10 000 — 100 000оС/мин в образцах происходит стеклование, или витрификация, воды — внутриклеточный и внеклеточный лед переходит в стекловидное состояние, минуя стадию образования кристаллов. Но в практике криобиологии трудно обеспечить большие скорости охлаждения, поэтому замороженные образцы имеют незавершенную кристаллическую структуру, которая уже при повышении температуры до -130оС превращается в обычный гексагональный лед — и эти кристаллы, естественно, повреждают клетки

Еще одно условие для возвращения к жизни - замораживание должно происходить сразу на всю глубину тела. Все клетки организма должны подвергаться заморозке или оттаиванию одновременно. То есть с огромной скоростью — 200 градусов Цельсия в минуту. При резком снижении температуры внутриклеточная вода не успевает превратиться в лед, а остается водой, только приобретает другие свойства. Однако это пока теоретические расчеты.

 #7. Хекстент — спасительная кровь.

 Наиболее перспективным криопротектором является вещество под названием “хекстент”. Два года назад американские ученые из калифорнийской исследовательской компании “Боитайм” оживили замороженных бабуинов! Секретом возвращения животных из небытия стала созданная ими плазма хекстент, которую назвали чудом XXI века. Эту жидкость ввели в тела обезьян через вену перед охлаждением. С помощью анестезии температуру тела животных снизили до 1 градуса по Цельсию. Хекстент, частично заменивший кровь, явился защитным механизмом для сохранения их жизнедеятельности. Выведенные из анабиоза приматы вернулись к жизни без всяких последствий. Ученый мир считает возможным в скором будущем выведение из глубокой заморозки и людей. А пока “побочные” эффекты этого явления можно использовать в медицине: при пониженной температуре тела проводить, например, пересадку органов; или операции с сильными кровотечениями (кровообращение снижается, и кровоточивость тоже); охлаждать тела раненых бойцов и доставлять их на качественное лечение в тыловые госпитали. Нечто подобное сделали ученым из американского научного центра в Питтсбурге. После трех часов клинической смерти им удалось вернуть к жизни собаку, температура тела которой предварительно была понижена до семи градусов по Цельсию. Тем самым впервые на практике доказана возможность анабиоза при критических температурах теплокровных млекопитающих, включая человека.

В ходе исследований ученые, постепенно снижая температуру тела собаки, удалили из ее организма всю кровь, заменив ее на специальный соляной раствор. После достижения температуры в семь градусов была зафиксирована остановка сердца, прекратил работу головной мозг и другие важнейшие внутренние органы. Спустя три часа после нахождения животного в состоянии анабиоза ученые начали медленно разогревать его. При этом соляной раствор заменялся на удаленную ранее из организма животного кровь. Когда температура тела собаки достигла нормы, с помощью электрического разряда было запущено сердца, которое немедленно заработало.

Многочисленные проверки показали, что в результате длительного "выключения" ни один из органов животного не пострадал. Собака чувствует себя хорошо, в ее поведении не наблюдается никаких отклонений. Эксперты считают, что аналогично будет вести себя и человеческий организм. Весь вопрос состоит в том, как долго можно продержать человека в состоянии анабиоза. Хотя опыты по критическому охлаждению организма млекопитающего уже проводились учеными, впервые они закончились успехом. Ранее у животных были зафиксированы нарушения в работе ключевых внутренних органов. Все говорит о том, что ученым из Питтсбурга удалось создать новейшую технологию, основанную на особом процессе охлаждения, а также применении специального состава жидкости, которая заменяет кровь.

Одновременно был сделан очередной шаг в познании механизма работы живого организма. Мировой науке известны случаи, когда люди, находившиеся без кислорода в течение достаточно длительного времени оставались живы в результате быстрой "остановки" самим организмом мозга и сердца. В подобных случаях человек полностью возвращался к жизни после медицинского вмешательства, которое ограничивалось стимулированием сердца.

#8. Человек из холодильника.

Первым замороженным человеком стал профессор психологии Джеймс Бедфорд из Лос-Анджелеса. Узнав, что умирает от рака легких, он в 1967 году сам согласился на то, чтобы его заморозили в жидком азоте при температуре - 196оС и вернули к жизни, когда медицина победит это смертельное заболевание. Взялось за это Калифорнийское крионическое общество. Ослепительные перспективы крионики — заснуть, пробудиться через десятилетия и оказаться в новом мире — у кого-то вызывают бурный энтузиазм, а кого-то побуждают к жесткой критике.

Развивая идеи физика Р. Эттингера, исследователи из американской компании «Trans Time», которая занимается замораживанием людей, рассчитали, что распад, происходящий в организме за 1 с в нормальных условиях, при -196 С будет длиться 30 триллионов лет. Таким образом, с остановкой жизненных процессов все складывается удачно. Проблема в другом: в их возобновлении.

Из предыдущих глав ясно, что современная криобиология достигла значительных успехов. Однако пока не существует методов, которые позволили бы заморозить и разморозить без повреждений целый орган, не говоря об организме. В подобных опытах мы всегда наблюдаем отек, гипоксию, разрушение клеток. Причины понятны. Орган — многоклеточная, гетерогенная система, имеющая форму, массу и объем. Следовательно, при замораживании в нем возникают температурные градиенты, холод не распространяется в тканях мгновенно. Клетки, из которых состоит орган, попадают в неодинаковые условия. В то время как клетки поверхностных слоев оказываются уже закристаллизованными, более глубокие слои находятся лишь в состоянии переохлаждения. Кроме того, орган по своему морфологическому строению не бывает однородным, поэтому при замораживании возникают проблемы с сосудами и нервными волокнами: ведь каждой ткани, каждому типу клеток нужен свой режим замораживания.

Таким образом, попытки экстраполировать принципы замораживания простейших и клеток на органы и особенно на организм теплокровных всегда неадекватны и в лучшем случае имеют лишь теоретическое значение. Уже сегодня мы можем сказать, что для консервации сложных биологических систем необходимы низкие скорости замораживания, вещества, обеспечивающие внутриклеточную защиту. Нужны технологии, пригодные и для массы однородных клеток, и для клеток, выполняющих различные функции. Но сегодня таких технологий у нас еще нет. И говорить о сохранении человеческой жизни путем сверхбыстрого глубокого охлаждения пока не представляется возможным.

Несмотря на это первыми крионическими организациями в период до 1980 года было осуществлено 20 замораживаний. Почти все пациенты (кроме Бедфорда, который в настоящее время находится в Фонде продления жизни Алькор) были разморожены и похоронены обычным образом. Размораживание пациентов и, вследствие этого, прекращение существования этих организаций были вызваны неправильной финансовой политикой, которую они применяли для обеспечения хранения пациентов. Деньги на хранение выплачивали родственники пациентов, и, как показала практика, они в конечном счете отказывались платить, что с неизбежностью влекло за собой размораживание. Также говорят, что люди перестали оплачивать счета, потому что тела их близких были неправильно заморожены. Например, родители, пришедшие навестить свою 8-летнюю дочь, погибшую в автокатастрофе, увидели, как из ее криостата спокойно выползают муравьи.

Благодаря усилиям энтузиастов крионика из теоретических предпосылок превращается постепенно в практический бизнес. Наиболее значительные шаги в этом деле предприняты американскими крионическими обществами. Там созданы крионические депозитарии Alcor Life Extension Foundation, Cryonics Institute, Cryocare Foundation, TransTime, в которые помещены около 100 замороженных тел. Число потенциальных клиентов, изъявивших желание быть посмертно замороженными, достигло уже 1500. Заморожено очень большое число домашних животных. Стоимость замораживания и бессрочного хранения составляет от $30 тыс. до $150 тыс.  В последнее десятилетие в России тоже стали появляться проекты создания крионического бизнеса.

Удавалось ли оживить превратившегося в ледышку человека? Да. В марте 1960 года в степи замерз тракторист целинного совхоза “Ярославский” Владимир Харин. Он пролежал в снегу три часа. Его оживили в актюбинской больнице. А в поселке Копорье Ленинградской области до недавнего времени жила бабушка Васильевна, которая во время войны помогла не только сохранить многим бойцам отмороженные конечности, но и вернула к жизни двух соседских детей. Они превратились в ледяные бревнышки, когда немцы раздели их на морозе… Народная медицина не считала это сверхъестественным. В “Полном простонародном русском лечебнике” целая глава посвящена оживлению замороженных заживо. Известны и другие феноменальные случаи воскрешения. Японец Массару Сайто, водитель рефрижератора, приехал в Токио за мороженым. И спрятался от жары в своем фургоне. Дверь захлопнулась. Обнаружили шофера, когда он замерз (температура внутри фургона была минус 10 градусов). Через несколько часов беднягу оживили. Вернуться с того света ему помог углекислый газ, который выделяет испаряющийся сухой лед. Избыток углекислоты подавляет в мозгу человека центр терморегуляции и снижает потребность организма в кислороде. Однако это примеры исключительной устойчивости человека к холоду, не более того. Люди в этих случаях не превращались в лед в прямом смысле слова: в глубине организма теплилась жизнь. Сегодня некоторые исследователи смотрят на проблему оживления людей с оптимизмом. Два года назад в Швейцарии вышла книга предсказаний на третье тысячелетие — “Reality Check”. Ее авторы утверждают, что уже в 2043 году станет возможным оживление и лечение людей, замороженных в жидком азоте. Вот тогда, вероятно, любой желающий сможет превратиться в лед хоть на тысячу лет. А в каждом веке можно будет оживать на некоторое время — посмотреть на новый, незнакомый мир, и опять погружаться в ледяную спячку. В общих чертах процедура криостаза (криоанабиоза) выглядит так.

Большие деньги предполагают самое современное оборудование, новейшие технологии... В "операционной" фирмы Alcor идет операция по замораживанию очередного кандидата на "бессмертие”.

Тело хранится в депозитарии в течение срока оговоренного в контракте (как правило, до появления технологии, которая позволит его оживить). При используемом способе хранения происходит постоянное испарение жидкого азота из криостата и его необходимо туда периодически добавлять. Для покрытия этих и других затрат по хранению тела в течение неопределенно долгого времени используется доход от вложения (в ценные бумаги, в банки под процент и т.п.) всех средств из стоимости криостаза, оставшихся после расходов на замораживание. Прошло более тридцати лет после того, как был заморожен первый человек (американский профессор психологии Джеймс Бедфор). Ослепительные перспективы крионики — заснуть, пробудиться через десятилетия и оказаться в новом мире — у кого-то вызывают бурный энтузиазм, а кого-то побуждают к жесткой критике.

#9. Свежемороженые органы.

 Если удастся безболезненно погружать человека на длительное время в анабиоз, то для медицины это будет иметь огромное значение. Известно, например, что такие органы, как сердце и легкие, после извлечения их из тела остаются жизнеспособными не более 6 часов, а поджелудочная железа и почки - не более суток. Таким образом, успех трансплантации зависит от времени доставки органа, и иногда приходится заранее транспортировать к месту проведения операции потенциального донора. Ежегодно в США успешно проводятся десятки тысяч операций по пересадке органов, но нередко из-за нехватки времени возникают нештатные ситуации.

Если бы предназначенные для трансплантации органы можно было перевести в состояние анабиоза, то в распоряжении врачей оказалось бы больше времени, сутки или даже недели. Погружение же в глубокий анабиоз жертв серьезных катастроф и аварий помогло бы спасти им жизнь.

Ткани мозга проявляют защитную реакцию. В мозг бодрствующих и введенных в состояние анабиоза животных был введен тонкий зонд. Спустя трое суток животных обследовали. У находившихся в состоянии анабиоза (слева), в тканях мозга было обнаружено лишь крошечное отверстие, оставшееся от зонда, никаких признаков повреждений или воспаления не наблюдалось. В отличие от них, у бодрствовавшего животного вокруг места введения зонда было видно множество мертвых клеток (справа), а по краям образовавшегося большого отверстия скопились иммунные клетки (черные точки).

Изолированные органы находятся под угрозой ишемического повреждения с того момента, когда их отключают от системы кровоснабжения организма-донора. Несмотря на инфузию холодного консервирующего раствора и транспортировку при низкой температуре, они могут потерять жизнеспособность, если до трансплантации пройдет слишком много времени. Это временное окно называется приемлемым, с медицинской точки зрения, временем "холодной" ишемии. По данным Объединенной сети по распределению органов, в прошлом году остались неиспользованными 3216 органов; несколько сотен из них всего лишь не были доставлены вовремя.

А помочь в решении этой проблемы могут черви. Ученые надеются выделить природные криопротекторы и понять остальные механизмы морозостойких свойств червей, что поможет хранить органы для трансплантации.

Черви Mesenchytraeus solifugus с каждым днём становятся всё более "горячей" темой для исследований. Их среда обитания может исчезнуть (вместе с ними) в течение ближайших 50 лет из-за глобального потепления, тогда как сами крошечные черви могут очень многому "научить" человечество. Ледяные черви населяет ледниковые области в прибрежных зонах Аляски, Британской Колумбии, Вашингтона и Орегона. Эти существа легко передвигается через снег и лёд, не выносят тепла и предпочитают температуру у ноля градусов по Цельсию (точки замерзания воды). По одной из версий, черви пробираются через крошечные трещины во льду, по другой — используют некое вещество, которое протаивает дорожку, проходя как тёплый нож через масло. Учёные рассчитывают, что исследование энергетического цикла и метаболизма Mesenchytraeus solifugus поможет усовершенствовать способы хранения в холодильнике органов и тканей для трансплантации, создать новые химические средства для этой цели.

Компания Human Biosystems сделала сенсационное заявление о том, что её специалистами осуществлена успешная обратная трансплантация трём крысам их собственных почек после охлаждения до температуры жидкого азота.

Почки трёх крыс были заполнены разработанным фирмой раствором ("HBS Preservation Solution"), охлаждены до -196оС и сохранены в жидком азоте в течение 3, 5 и 7 дней соответственно, после чего пересажены обратно. При этом по утверждению доктора Луиса Толедо, главного медика компании, почки начали производить мочу, "что является важнейшим показателем жизнеспособности органа". Показатель реперфузии почек (характеризующий их жизнеспособность) составил 14 из 15 возможных, "что прекрасно".

По словам доктора Толедо, почки находились в состоянии витрификации, т. е., в них не образовывались кристаллы льда, что позволило избежать повреждения этими кристаллами клеток.

Из сообщения не совсем ясно, прижились ли пересаженные почки обратно - во всяком случае, напрямую это не сказано. Здесь следует отметить, что ещё несколько лет назад специалисты фирмы 21st Century Medicine, разрабатывавшие технологию витрификации, используемую теперь крионической фирмой Alcor для витрификации головного мозга пациентов, осуществляли и витрификацию почки кролика, которая значительно больше, чем почка крысы. В их экспериментах почка также выделяла мочу, но отказывала через несколько дней из-за криотравмы и последствий токсичности криопротектора.

Если в этом случае удалось достичь реальной жизнеспособности трансплантированного органа, это будет обозачать прорыв в трансплантологии и веский довод в пользу целесообразности крионики.

Слева - замороженная почка. Справа - почка, прошедшая витрификацию

 #10. На что еще способен холод?

 В отделе клеточных культур Института цитологии находится всероссийская коллекция клеточных культур, точнее — их центральный банк, самый большой в стране. Здесь собрано около 600 тысяч пробирок, а клеточных штаммов — около 800 тысяч, которые хранятся в металлических емкостях с двойными стенками, с вакуумной и слоисто-порошковой изоляцией между ними. Жидкий азот в них восполняется дважды в месяц. Вырабатывается этот сжиженный газ из воздуха собственной установкой в соседнем помещении. Специальный прибор позволяет руководить ступенчатой заморозкой культур. В жидком азоте успешно хранится сперма.

Мужские половые клетки почти не содержат жидкости, поэтому успешно восстанавливаются после размораживания. Можно сохранить генный материал вымирающих видов животных. В коллекции есть клетки мамонтенка Димы, которые американцы меняли у нас на лунную пыль. К сожалению, целой клетки в условиях вечной мерзлоты не сохранилось. Можно было бы создать банк клеток кожи (и всех органов) каждого человека или хотя бы представителей профессий повышенного риска (пожарных, военных, спасателей, шахтеров и т.д.). Биологи убеждены, что их эксперимент, кроме теоретической, имеет безусловную практическую ценность для медицины. «Человеческий» анабиоз даст возможность пациентам, нуждающимся в срочной трансплантации, дождаться появления нужного органа. Кроме того, станут осуществимыми тысячелетние космические путешествия, в которые будут отправляться космонавты в состоянии анабиоза

Как показали исследования, проведенные в лаборатории Центра онкологических исследований Фреда Хатчинсона, можно вызвать искусственную гибернацию, напоминающую зимнюю спячку, у животных, которым в норме подобное поведение не свойственно. При этом они безболезненно переносят такие неблагоприятные условия, как большая потеря крови и кислородное голодание. Такие результаты позволяют надеяться, что когда-нибудь в состояние "отсроченной анимации" (suspended animation) можно будет переводить и человека. По крайней мере, те методы, которые мы использовали в опытах на лабораторных животных и тканях человека, предполагают такую возможность. Способность к гибернации, по-видимому, заложена во многих организмах и восходит своими корнями к самым ранним стадиям жизни на Земле.

В 60-70-х годах в Институте проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины академик В.И. Грищенко, Е.Я. Панков и Э.И. Алексеевская разработали концепцию криообновления, согласно которой с помощью низких температур можно изменить регуляцию клеточного генома. При этом у биообъектов, в том числе и у человека, активизирются жизненно важные функции и развивается устойчивость к холоду.

В последнее время не раз появлялись сообщения о повышении урожайности сельскохозяйственных культур, продуктивности микроорганизмов — производителей антибиотиков, улучшении качества винной продукции после воздействия низкими температурами. «Закаленные» растения (женьшень, озимые злаки, виноград) легче переносят последующие охлаждения. После криообработки семена лучше всходят, повышается сахаристость плодов — ведь растения в качестве криопротектора накапливают сахарозу.

Заключение.

 Таким образом, мы видим, что перспектив у криобиологии более чем достаточно. Однако на своем пути ученые столкнулись с множеством проблем, некоторые из которых уже решены и подтверждены удачными опытами. Главной проблемой до сих пор остается вопрос: «Как разморозить организм, не навредив ему?”, “Как заставить его снова жить и нормально функционировать?” Как бы то ни было поставлена заманчивая проблема, - умирая, заснуть, пробудиться через десятилетия и оказаться в новом мире".

Многие считают, что все это нереально, бесполезно и бессмысленно. На сегодняшний день лишь небольшая часть научного сообщества рассматривает крионику как реальную технологию. Однако, несмотря на это, в последние несколько лет наблюдается постоянный рост крионики (т.е. количества замороженных людей, членов крионических организаций и сторонников крионики), который имеет тенденцию к ускорению - особенно после недавних научных достижений в области нанотехнологии. Они дали понимание того, как можно оживлять замороженных пациентов. Не последнюю роль в недавнем росте членов крионических организаций сыграл постоянный интерес к крионике со стороны средств массовой информации. Причем, если раньше отношение к крионике было в основном ироничным, то в последнее время оно стало серьезным и объективным, а в недавнем обзоре, посвященном продлению жизни, опубликованном в журнале "Тайм" крионика, наряду с нанотехнологией, названа наиболее перспективным методом для достижения "вечной молодости".

И в заключение одна небольшая история, приключившаяся в 1924-м году в Германии. Внешне эта необычная торговая сделка выглядела совершенно невинно: Советская Россия закупала за рубежом холодильное оборудование, а уж как оно будет использоваться, фирму-продавца, прямо скажем, мало интересовало. И только впоследствии выяснилось: с помощью импортного оборудования русские собирались замораживать не говядину или баранину, а... тело только что умершего вождя пролетариата.

Идею таким образом сохранить на века труп Ленина подал его давний соратник, единственный технократ в правительстве большевиков Леонид Красин. Знакомый с популярным тогда движением биокосмистов, он разделял их надежды на счастливое будущее человечества, в котором удастся воскрешать лучших его представителей...

С тех пор в науке, а особенно, в биологии, было сделано ни одно революционное открытие. Прогресс не стоит на месте, и кто знает, может быть в будущем мы сделаем нереальное реальностью.

#Список использованных источников:

1. Г.А. Бабийчук, В.И. Грищенко “Проснутся ли спящие”//Химия и жизнь-2001г-№5-С. 9-13

2. В.И. Грищенко, Э.И. Алексеевская “Криобиология - основа для прогресса в биологии и медицине” // Успехи современной биологии-2003-№5-С.435-444

3. Н.Ю. Колесников “Хочу бессмертия”//Seagull-2005-№12

4. Шилов И.А. Экология. Учебник для биологических и медицинских вузов. – М.: Высшая школа,-2003.- 356с.

5. www.kriorus.ru

6. www.cryonic.ru

7. www.medtrust.ru

8. www.elementy.ru/news

9. www.cryo.org.ua

Источник: http://www.allbest.ru

 

Поделиться